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    TaqMan SNP基因分型

    TaqMan?SNP基因分型技術利用Taq聚合酶的5'核酸酶活性在PCR期間產生熒光信號。對于每個SNP,該分析使用僅在SNP位點序列不同的兩種探針,一種探針與野生型等位基因互補,另一種與變異等位基因互補。該技術利用FRET技術,將5'報告基因染料和3'淬滅染料共價連接至野生型和變異等位基因探針。當探針完好無損時,熒光會被抑制,因為淬滅染料位于報告染料的附近。在PCR退火步驟中,探針與目標SNP位點雜交。在PCR延伸過程中,由于Taq聚合酶的5'核酸酶活性,導致報告染料和猝滅染料被釋放,從而導致報告染料的特征熒光增強。核酸外切酶活性僅在完全雜交的探針上發生,因為含有錯配堿基的探針不會被Taq聚合酶識別。

    PCR反應結束時,將測量兩種報告染料的熒光信號。信號的比率將指示樣品的基因型(見圖)。

    TaqMan SNP genotyping

            在大多數測定中,使用第三種染料(例如ROX)的信號對兩種報告染料的熒光信號進行標準化,其強度與模板DNA濃度和PCR反應程度成正比。通常,報告染料信號在圖中可見。許多相關的基因分型系統都采用了報告猝滅劑技術(例如Invader?,MolecularBeacons?,Scorpion?和其他探針技術),并且可以使用SNP基因分型插件以與TaqMan?探針相同的方式進行分析和可視化。

    BioNumerics中的SNP分析

    BioNumerics SNP識別插件為可靠的SNP識別和基因分型提供了一個全自動平臺。該插件非常靈活,可以適應TaqMan SNP基因分型數據分析的不同工作流程:

    1.       在其他軟件中執行自動識別,然后將識別及其相應的置信度值導入BioNumerics中。

    2.       在Bionumerics導入過程中執行自動識別。

    3.       將數據導入為“未識別”,然后在SNP識別窗口中執行自動識別。


    通過其豐富的集成環境,BioNumerics提供了許多其他軟件工具無法提供的功能:

    l                      強大的數據庫基礎,包括用戶和安全功能以及符合最高標準的可選審計追蹤功能。

    l                      一個用于分析SNP基因型數據的平臺,以及許多其他技術,例如HDA / CSCE、MLPA、微衛星、序列分析等。

    l                      從導入原始數據到報告結果和問題樣本的自動化程度無可比擬。此外,該軟件可使用Python進行完全腳本化,以實現各種定制化操作。因此,BioNumerics非常適合高通量分析。

    l                      BioNumerics提供了多種數據挖掘、分析和統計工具,可對大型數據集進行聚類、統計分析和假設檢驗。

    Supported file formats for SNP genotyping

    導入SNP數據

    目前,該插件支持五種不同的文件格式(可以根據要求添加其他格式):

    l                      Applied Biosystems?7900HT Fast Real-Time PCR System: 包含已處理的384孔板讀數TXT文件

    l                      BMG Labtech 384孔微孔板讀取器:包含微孔板中的原始熒光值DAT文件

    l                      Douglas Scientific Array Tape system生成的格式為384孔TXT文件。

    l                      Fluidigm?Dynamic Array, 包含多達9,216個數據點(針對96個SNP測試了96個樣本)的CSV文件

    l                      Tecan Safire或Tecan Infinite微孔板讀取器生成的TXT文件,為96孔和384孔微孔板格式

    可以批量導入多個文件,并且可以選擇在導入過程中軟件執行自動SNP識別。

    自動識別SNP

    自動識別SNP算法是插件中最關鍵的元素,并決定了在高通量環境中有效且成功的SNP基因分型。BioNumerics使用基于種子的迭代分區算法來根據現有基因型識別SNP聚類。自動識別設置分為兩個選項卡,分別代表SNP分配的常規設置和閾值(左圖)以及分區算法的高級設置(右圖)。 盡管默認分區設置通常表現出色,但可以針對任何特定數據源進行優化。該算法還可以在多倍體基因組中成功識別SNP(從理論上說是七倍體)。

    Advanced settings for the autocall algorithmGeneral settings for the autocall algorithm

    SNP識別窗口

    可以在SNP識別窗口中打開單個或多個SNP文件。左上面板列出了在所選文件中找到的所有SNP,可以從中選擇單個SNP以顯示在繪圖窗口中。SNP識別還可以按文件或針對選定文件(左下面板)繪制。

    在圖中,可以使用套索選擇工具選擇識別的SNP。

    SNP calling window

    SNP calling in plot with Cartesian coordinates

    默認情況下,SNP識別根據定義的接合性識別、NTC識別和“未識別”(上圖)以不同的顏色顯示。這些顏色可以由用戶更改。識別的統計置信度也可以用作繪圖顏色的基礎(右)。在第三種視圖中,顏色基于SNP文件顯示。

    SNP識別可以通過其置信度,ROX信號或其他參數進行排序和過濾。

    可以使用直角坐標、極坐標和對比度坐標(如下所示)顯示該圖。


    SNP calling in plots with polar and contrast coordinates

    用戶可以更改所選的SNP識別。 對于每個識別的SNP,軟件都會顯示是手動分配還是自動分配??梢詫С鰩в?/span>識別和置信度信息的制表符分隔的文件,以便在數據庫中選擇任何樣本。

    分析和基因分型

    BioNumerics中的分析不以SNP的識別結束。該軟件為數據挖、聚類、篩選、識別和統計分析提供了許多高級工具。豐富的分析平臺與強大的數據庫功能相結合,使BioNumerics非常適合在實驗室范圍內或實驗室間進行長期基因分型的項目。最重要的是,BioNumerics還為各種其他基因分型技術提供了同樣強大的工具,包括AFLP譜帶評分、MLPA分析基因組測序和SNP分析等。不同技術的結果可以各種方式組合起來,以獲得更確定的分析。

    下圖是胡蘿卜樣本和SNP的雙向聚類示例,很好地說明了一方面樣本組與另一方面SNP組之間的相關性。

    Transversal clustering of SNPs

    可以使用高級查詢生成器在整個項目和數據庫中篩選具有特定基因型(合子性的組合)的樣本。 為了實現更高水平的篩選和自動化功能,可以構建決策網絡。

    Advanced query tool for finding SNP calls

    Decision network for finding SNP calls

    該應用程序的實現是通過BioNumerics中基于許可證的SNP調用插件實現。請與供應商聯系以獲取許可信息。



            IMG_256   中科logo

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    2020年5月8日 16:36
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